本发明公开了用于T－A克隆的T载体制备方法，选择一个高拷贝数的常用质粒，以此质粒为模板设计四对引物，通过定点突变构建两种在特定序列有差异的突变质粒；在两种突变质粒的多克隆位点处分别构建TTTTAAA及TTTAAAA序列盒，并分别引入两个不同的酶切位点BamHI和HindIII；将突变质粒分别导入细菌扩增，并将扩增的等量质粒用可识别TTTAAA序列的内切酶切割，混合、变性、复性，反应后的混合物酶切，去除亲本分子，即可分离出T载体。本发明采用独特的生物合成技术生产T载体，这种由生物合成的天然T载体，具有合成方便，生产成本低，克隆效率高，质量稳定等特点，用本方法构建的T载体完成了多个基因的克隆，结果表明其重组效率达到了90％以上。