本发明公开了一种检测炭疽芽孢杆菌的免疫层析试纸及其制备方法。该检测炭疽芽孢杆菌的免疫层析试纸，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫一端的含有炭疽芽孢杆菌单克隆抗体或多克隆抗体标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜(NC膜)和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为炭疽芽孢杆菌单克隆抗体或炭疽芽孢杆菌兔多克隆抗体，所述质控线为抗鼠抗抗体或抗兔抗抗体。本发明用于临床标本、污染物和环境中炭疽芽孢杆菌抗原的检出，也可用于纯培养炭疽芽孢杆菌的鉴定。