本发明公开了一种由药物敏感虫株组成的鸡球虫病四价活疫苗制备方法，它是在偏僻山区散养鸡中采集鸡球虫样品，以实验室笼养试验法和球虫耐药性检测技术筛选出药物敏感株，并以这些药物敏感株为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，选育获得柔嫩艾美耳球虫Eimeria tenella、堆型艾美耳球虫E.acervulina、巨型艾美耳球虫E.maxima、毒害艾美耳球虫E.necatrix的早熟系，研制出鸡球虫病四价(含柔嫩、毒害、巨型、堆型4个种)活疫苗。上述四价活疫苗一方面具有发挥其免疫防制鸡球虫病的作用，另一方面发挥其稀释—替换现有多重耐药野外虫株的潜能，恢复常用化学抗球虫药物的抗球虫效果，使化学防治重获新生，使鸡球虫病的防治走上良性循环之路。