本发明涉及一种利用ATP生物发光法进行微生物数量快速检测的方法及检测试剂盒，快速检测试剂盒包括荧光素酶及其保护剂、D－荧光素、标准ATP、发光检测缓冲液、非细胞ATP去除剂、微生物细胞ATP抽提剂等试剂。应用该检测试剂盒进行微生物数量快速测定的标准方法是通过在选定的生物发光仪和选定的系统中做ATP标准曲线，取对数后得到线性回归方程，将经过非目的ATP去除和微生物ATP抽提的样品液，在同样的仪器和系统中用同一批酶进行ATP生物发光检测，同时做空白对照，得到样品和空白的CPM或RLU值，去除空白后的净相对发光值取对数后，通过建立的回归方程得到样品的ATP浓度，根据细菌、酵母、霉菌和单细胞微藻等微生物的ATP含量可换算成细菌、酵母、霉菌孢子或单细胞微藻的细胞数，或只计相当于细菌数量。