本发明公开了一种从雷公藤中分离制备雷公藤内酯二醇的方法。它是将含雷公藤内酯二醇的雷公藤根皮提取物做原料，用混合溶剂萃取数次，得到的固体物分散在水中用有机溶剂萃取数次，收集有机相，蒸干得到的固体物上一次硅胶柱或中性氧化铝柱，用二氯甲烷、三氯甲烷或二氯乙烷洗脱，得到雷公藤内酯二醇粗品，用二氯甲烷－乙醚结晶，得到雷公藤内酯二醇粗晶，重结晶两次，即得纯晶。本发明所用原料廉价易得，对环境污染小，工艺简单易行、快捷，所获得的雷公藤内酯二醇成本较低、纯度高，适合工业规模化生产。