本发明涉及两步法双重RT－PCR同步检测马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒，三重RT－PCR同步检测马铃薯X病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒的方法及检测试剂盒，是专门针对马铃薯产业影响较大的5种马铃薯病毒而建立的一种同步检测2或3种病毒的快速方法，检测时间仅用4h，且灵敏度高、特异性强、稳定可靠。该方法克服了现有对马铃薯病毒病依据症状学的常规诊断方法误判率较高、血清学方法难以检测休眠马铃薯中的病毒及病毒含量较少的韧皮部病毒—马铃薯卷叶病毒等缺点；该方法适用于马铃薯种苗、种薯多种病毒病的早期诊断，对马铃薯种薯质量监测和病毒病预防有着重要的作用。