本实用新型公开的多分离柱双向逆流色谱仪，包括可绕箱体中心的固定空心轴中心公转同时又绕分离柱空心轴中心同步同向自转的分离柱，及与分离柱连接的引入管、引出管和与分离柱空心轴成对的同步逆向自转的解绞空心柱，其中分离柱具有三个或三个以上，每个分离柱至少连接有一个管路连接器，连接有管路连接器的分离柱依次通过连接管串联连接。该双向逆流色谱仪利用串联连接的分离柱进行分离，从第一个分离柱的首端引入第一相流体和引出第二相流体，从第二个分离柱引入待分离的物料，从最后一个分离柱的尾端引入第二相流体和引出第一相流体。本实用新型可有效提高仪器的平衡能力，提高了单机的制备能力，特别适合于生物样品的大规模制备。