本发明公开了一种基于多通道免疫层析检测的孵育上样装置，目的是实现多通道孵育与同时上样。该装置由顶盖、密封型检测柱、进样盖板、进样管路、底座、孵育盘构成。所述顶盖，对密封型检测柱顶端进行密封，提供混匀与进样所需压力环境；所述密封型检测柱用于进行层析反应；所述进样盖板用以封闭底座；所述进样管路提供孵育样品的进样通道；所述底座用以盛放上样溶液；所述孵育盘，用于盛放酶标孔，实现预孵育反应。本发明也可用于无需预孵育步骤项目的检测，该装置所需压力变化的环境可以通过手动或者自动装置实现压力变化，进而实现多通道孵育与同步进样。可应用领域涵盖临床诊断、检验检疫、食品安全检测、司法鉴定等，具有广阔的市场前景。