本发明公开了一种针对中性疏水性多肽的纯化方法，主要解决现有对于中性疏水性多肽难以纯化，难以获得高纯度产品或者产品得率极低的问题。本发明纯化包括中性疏水性多肽的强弱分类概念，溶解方法的选择，色谱柱的选择，分析与制备流动相的选择以及洗脱收集的步骤。所述的中性疏水性多肽序列中含有Ala,Ile,Val,Leu原料的多肽；中性疏水性多肽的溶解方法可以选择六氟异丙醇或尿素中的一种溶解，也可以选择丙酮或异丁醇中的一种大量稀释震荡搅拌，经过硅藻土与硅胶填料不同配比做成的PE柱过滤得清液；色谱柱的选择为以硅胶键合的固定相填料的色谱柱或者以聚苯乙烯二乙烯苯为基质的固定相填料的色谱柱，分析与制备流动相的选择根据溶解方法的不同来选择特有的体系，并进行疏水性多肽的洗脱收集。