本发明公开了一种高通量光学层析成像方法及成像系统，方法包括将光束调制成能够在物镜的焦平面聚焦并能够在物镜的离焦面发散的调制光束，该调制光束在物镜的焦平面具有不完全相同的调制强度；对调制光束照明下的样本在不同像素下进行成像，获取不同像素下的样本图像；将不同像素下的样本图像通过解调算法解调获取样本图像的焦平面图像；系统包括光束调制模块、成像模块及解调模块。本发明通过具有不完全相同的调制强度的光束进行照明，并基于同一样本在不同的像素下进行成像后，采用较简便的解调算法得到焦面图像；其简化了结构光重建算法、提高了重建效率，并提高了大尺寸样本的成像速度。