本发明提供一种精确定量检测免疫层析试纸条的制备方法，其中，结合垫的制备中，包括：S1：裁切结合垫：将结合垫裁切成组装成成品时所需要的尺寸；S2：标记复合物的制备：在标记物标记上抗体或抗原后，置于保存液中存放；S3：配制标记复合物的浸泡液：将稀释液与上述含有标记复合物的保存液混合稀释成一定浓度的标记复合物的浸泡液；S4：浸润结合垫：将定标记复合物的浸泡液加入结合垫中，浸润；S5：结合垫平衡过程：将浸润的结合垫平铺于载体上，在恒温恒湿环境中静置；S6：干燥结合垫：将平衡完成的结合垫进行干燥。本发明的方法能有效提高试纸条精密度以用于精确定量检测，且制备方法简单，生产效率高，生产成本低，便于工业化生产。