本发明提供了一种酶基复合纳米探针及其制备方法和应用。所述酶基复合纳米探针为纳米核壳结构，其核体包括上转换纳米粒，用于包覆所述核体的壳层的材料包括用于包覆所述核体的油酸层、与所述油酸层结合的两亲性聚合物，在所述油酸层与两亲性聚合物共同构成的疏水区域还负载有氧气敏感荧光分子，在两亲性聚合物上还结合有D‑氨基酸氧化酶基团。所述酶基复合纳米探针通过所含的核体和壳层之间的协同增效作用，有效整合近红外光体内检测效果好和D‑氨基酸氧化酶基团特异性高的优点，赋予其灵敏度高、特异性强、非入侵等优点，从而实现体内D‑氨基酸的高效检测。另外，所述酶基复合纳米探针结构稳定，性能稳定，且其制备方法工艺条件可控，制备的酶基复合纳米探针性能稳定。