本发明公开了一种用于检测生殖支原体的试剂盒，包括两种方案：方案一是两种试剂，包括甲硫氨酸氨基肽酶和白细胞酯酶，其中检测甲硫氨酸氨基肽酶活性用的酶底物为含有色原的甲硫氨酸衍生物；检测白细胞酯酶活性用的酶底物为含有色原的酯类衍生物。方案二为三种试剂，即在方案一的基础上还包括脯氨酸氨基肽酶检测试剂，检测脯氨酸氨基肽酶活性用的酶底物为含有色原的脯氨酸衍生物。本发明通过干化学酶法检测生殖支原体在生长过程中自身合成的酶或刺激寄生细胞产生的酶，达到检测生殖支原体的目的，具有快速、简便、准确等优点。采用本发明试剂盒检测生殖支原体，灵敏度和特异性均较高，与现有同类检测试剂性能相近，可完全满足临床检测需要。