本发明公开了一种双波长微生物生化反应动态判读检测方法。该方法对微生物生化鉴定试验孔的吸光度采用双波长进行动态实时检测，分段拟合双波长吸光度的比值后，通过求曲线的速率和加速度，可预判反应孔的阴阳性，进而快速鉴定细菌种属，所述预判反应孔阴阳性的方法为：求双波长吸光度的比值，分段滚动拟合其曲线，求其速率或加速度，阳性单调递增(递减)，阴性基本不变或单调递减(递增)。本发明的方法特别适用于颜色和浊度同时变化的微生物生化反应，通过动态监测反应孔中浊度和颜色的综合变化，分段拟合双波长吸光度的比值，求出曲线的速率或加速度，可准确提前预判鉴定试验孔的阴阳性，可实现细菌的快速鉴定。