本发明属于医药技术领域，公开了炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物的合成方法及其应用。本发明将脱氧腺苷的N6位进行羧基化，再经过炔基修饰得到中间体，经过5'端羟基的保护和2'端亚磷酰胺化两步反应得到炔基修饰脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物。通过DNA的固相合成，将其定点导入到寡聚核苷酸中得到特定位点炔基修饰的寡聚核苷酸。本发明将炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物应用于寡聚核苷酸炔基修饰，方法简单，产率可观。为后续DNA的功能化提供了新的思路和有价值的中间体，应用前景广泛。