本发明涉及药物检测领域，提出一种同时测定葡萄糖酸氯己定和对氯苯胺含量的方法。该方法包括：用高效液相色谱法测定混合对照品溶液和供试品溶液，色谱条件为：以磷酸二氢铵溶液为流动相A，甲醇为流动相B，分别对混合对照品溶液和供试品溶液进行线性梯度洗脱，并且在线性梯度洗脱的过程中控制磷酸二氢铵溶液的体积，使得流动相A的体积占流动相总量的百分比由75％‑85％降低至35％‑45％，接着升高至75％‑85％，其中，混合对照品溶液是通过将醋酸氯己定对照品和对氯苯胺对照品混合制成。本申请通过采用高效液相色谱法，通过特定的流动相组成以及线性梯度洗脱程序，实现对葡萄糖酸氯己定和对氯苯胺的含量进行同时且准确的测定。