本发明公开了一种基于彩色复用照明的单帧差分相衬定量相位成像方法，采用彩色复用照明方案实现单帧差分相衬定量相位成像，单帧彩色复用照明方案具体方法采用红r、绿g、蓝b三个照明波长同时照射样品，将样品多个方向的频率信息转换为单幅彩色图像不同通道上的强度信息，通过通道分离得到所有方向上的频率信息。本发明的复用彩色照明方案仅需一幅采集图像，增强了单帧差分相衬成像的相位传递函数在整个频率范围内的传递响应，实现了高对比度、高分辨率、高稳定性的实时动态定量相位成像，并给出了一种交替照明的策略，在相机采集极限速度上实现了完全各向同性的成像分辨率。