本发明公开了一种基于图像熵的三维培养人体心肌细胞搏动特性检测方法包括如下步骤：将心肌细胞搏动视频序列帧的第一帧作为参照图像；将参照图像转换为灰度图像；获取参照图像中各心肌细胞团的心肌细胞团子图像，及心肌细胞团的参考区域；计算各参考区域的图像熵；将第一帧之外的心肌细胞搏动视频序列帧作为实时图像，对实时图像进行灰度处理；计算实时图像中每个心肌细胞团参考区域的图像熵；绘制各心肌细胞团的心肌细胞搏动曲线；获取心肌细胞搏动曲线中的心肌细胞搏动频率及幅度。图像熵和图像分割技术可以自动检测心肌细胞搏动特性，具有智能化、非入侵、无标记、低成本、可重复、实时处理优点。