本发明提供了一种荧光淬灭胶体金层析试纸条，其包括底板，以及由左向右依次设置在该底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；样品垫与结合垫、结合垫与硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜与吸水纸的局部相互层叠；在所述结合垫上设置有金纳米颗粒，在金纳米颗粒上标记有待检测物的抗体；在硝酸纤维素膜上固定有双激发双发射的上转换纳米颗粒标记的检测物的抗原及检测T线；上转换纳米颗粒可同时在两种的不同近红外光激发下发出红光或绿光。本发明还公开了其制备及检测方法。本发明提供的层析试纸条及其检测方法，能在近红外光激发下直接观测结果、对敏感组分进行精准的定量检测，消除了背景干扰，背景值低、信号稳定、灵敏度大大提高。