本发明公开了一种精子活性氧含量的测定方法，包括步骤如下：配置反应液，将稀释液与氯化硝基四氮唑蓝冻干粉混合，充分混匀，室温放置；取液化精液与反应液充分混匀，置于水浴箱，放置；离心，弃上清液，加入稀释液，混匀；取步骤三中试剂涂片，滴加染色液，室温反应，滴加染色缓冲液与所述染色液混匀，室温反应，洗去染液，干燥；观察步骤四中的涂片，以不含甲臜颗粒的精子作为活性氧阴性精子，含甲臜颗粒的精子作为活性氧阳性精子。观察精子，分别计数活性氧阳性精子及活性氧阴性精子数，计算活性氧阳性精子百分比；本发明观察结果完全不受精液中白细胞的影响，可以真实反映出待测精子活性氧含量。