本发明涉及血清样本中小分子代谢产物丙酸、亮氨酸及羟脯氨酸作为联合标志物在制备用于区分受试者中的食管上皮非典型增生患者及食管健康人群的试剂盒中的新应用。本发明还涉及检测受试者中的食管上皮非典型增生患者的试剂盒，通过检测来自受试者的血清样本中上述联合标志物的相对浓度，基于线性回归方程计算所述联合标志物变量P，再基于确定的阈值判断所述受试者是否患有食管上皮非典型增生患者。所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明涉及的几种代谢物，具有检测成本低，重复性好的特点。本发明可应用于临床辅助诊断食管上皮非典型增生患者，具有诊断灵敏度高、特异性好的特点，具有较好的应用前景。