本发明属于农业技术领域，具体涉及一种大麦黄花叶病室内接种用幼苗及接种后幼苗的培养方法，包括以下步骤：将大麦种子休眠破除与消毒后均匀排放于湿润纸床上，置于发芽箱内催芽，出芽后移栽到装有基质的育苗钵中，将育苗钵整齐放置于塑料槽中，将塑料槽放入人工气候箱中培养，在塑料槽中加水，幼苗长至二叶一心期进行大麦黄花叶病病毒接种；将接种后幼苗置于人工气候箱进行遮光处理；遮光处理结束后，置于光照、黑暗交替的光照周期中进行培养；在排放育苗钵的长方形塑料水槽内加入营养液，保证幼苗生长所需要水分和养分的供应。本发明所述方法可以排除非目标病毒的干扰、简化操作流程，保证病毒接种成功率及病毒的均匀扩散。