本发明涉及一种低高聚体含量聚合血红蛋白的制备方法，具体提供了交联血红蛋白的制备方法，包括：a、稀释脱氧血红蛋白；b、交联剂戊二醛与所述稀释脱氧血红蛋白发生交联反应；c、加入还原剂终止交联反应,用超滤换液的方式除去未反应的交联剂和终止还原剂,得到交联血红蛋白；其中：所述步骤a中，稀释脱氧血红蛋白浓度到1‑3g/dL，在所述血红蛋白中加入N‑乙酰‑L‑半胱氨酸，使溶液中血红蛋白与N‑乙酰‑L‑半胱氨酸的质量比为5‑10:1；且血红蛋白与交联剂的质量比为1000:29‑45。该方法制备的聚合血红蛋白中，不仅二聚体的含量较低，高聚体的含量也较低。