本发明公开了一种用于脊髓损伤修复的3D打印生物墨水、制备方法与应用。所述制备方法包括：对壳聚糖进行化学改性，获得羟丁基壳聚糖；将巯基、二乙烯砜基分别修饰到透明质酸上，分别获得巯基修饰的透明质酸、二乙烯砜基修饰的透明质酸；将羟丁基壳聚糖、巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明质酸混合均匀，获得3D打印生物墨水。本发明的3D打印生物墨水在37℃条件下能够快速固化成胶，利用巯基修饰的透明质酸和二乙烯砜基修饰的透明质酸之间可发生二次自交联，使得3D支架结构更加稳固，不易塌陷；本发明的生物墨水适合于装载神经干细胞的生物3D打印，所获得的水凝胶支架力学强度可与脊髓组织匹配，可以促进脊髓损伤的修复。