本发明提供了一种用于免疫荧光层析检测的全血分离膜及其制备方法和应用，属于生物样品处理技术领域，所述用于免疫荧光层析检测的全血分离膜，以玻璃纤维膜为基材，在所述玻璃纤维膜上固定有抗原特异性的共轭接合物、封闭试剂、共轭接合物释放试剂和亲水试剂；所述抗原特异性的共轭接合物由与目标检测物特异性结合的多克隆抗体、免疫球蛋白G和具有荧光标记物的微颗粒组成。本发明提供的全血分离膜特性稳定，红细胞分离效率高，能去除干扰物质的影响，增加免疫特异结合，保障了检测结果的准确性和可重复性。