本发明涉及一种基于莫洛尼氏鼠白血病病毒的自失活载体及其应用。该基于莫洛尼氏鼠白血病病毒的自失活载体包含：5’LTR、目的表达基因或用于插入目的表达基因的多克隆位点、3’LTR和多聚腺苷酸化核酸片段，其中自失活载体的5’LTR的U3区的PvuII酶切位点到SacI酶切位点之间的核酸片段被CMV增强子和与所述CMV增强子连接的CMV启动子替代，自失活载体的3’LTR的U3区的PvuII酶切位点到SacI酶切位点之间的核酸片段被删除，多聚腺苷酸化核酸片段位于3’LTR的3’端。该自失活载体作为基因治疗的载体具有较高的安全性、病毒滴度高且可高效表达目的基因。