本发明提供了一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法及装置和应用，该方法主要包括：先利用高孔隙率精准微孔滤膜对样本中的背景细胞和稀有目标细胞分别实现初次高效率去除与回收；再利用与背景细胞特异结合的免疫磁珠对背景细胞进行再次去除；最后，再次利用微孔滤膜对稀有目标细胞进行回收和富集。本发明提供的“先滤膜过滤，再磁珠负选”的方法，在实现背景细胞最大限度去除，保证稀有目标细胞高细胞活性、高体积通量、高灵敏度、高纯度分离与富集的同时，降低了免疫磁珠用量及经济成本。因此，本发明提供的方法，不仅操作流程简单、集成度高，避免了离心、液体转移等造成的细胞活性降低；而且经济成本低、装置便携，应用范围广、潜能大。