本发明涉及微生物分子生物学检测技术领域，具体涉及用于拟分枝杆菌属细菌鉴定的分子标记、特异性引物和方法。本发明发现位于葡萄糖‑6‑磷酸异构酶pgi基因到乙酰辅酶A乙酰转移酶ACAT基因的基因组区段内的基因排列区具有拟分枝杆菌属特异性，可用于拟分枝杆菌属水平的鉴定，其中部分单基因还具有拟分枝杆菌种水平特异性，可用于拟分枝杆菌种水平的鉴定。基于此，本发明建立了利用PCR技术鉴定拟分枝杆菌的方法，可直接根据PCR扩增结果进行判断而无需测序，更适用于临床样本的特异性快速检测，可广泛应用于拟分枝杆菌的临床检测和鉴定以及结核病的辅助诊断和流行病学监测等相关领域。