本实用新型涉及细胞培养器具的技术领域，具体是一种双层分隔式细胞培养瓶。一种双层分隔式细胞培养瓶，培养瓶的瓶身一侧开设有带有倾斜瓶颈的瓶口，且瓶口上螺纹配合安装有带有透气膜的瓶盖，培养瓶的瓶身内设有水平的第一隔板将瓶身分割为上下两层；瓶颈内设有倾斜的第二隔板将瓶颈分隔为上下两层，且瓶身的上下两层和瓶颈的上下两层对应连通，且第二隔板倾斜角度和瓶颈倾斜角度相同；瓶颈对应着瓶口的一端罩设有分隔膜，本实用新型的双层分隔式细胞培养瓶将原有的细胞瓶结构分隔为两个独立的培养空间，可以一定程度增加细胞培养的空间，并且两个独立的培养空间可以分开培养不同的细胞种类，提高了细胞瓶的利用率。