本实用新型公开一种微生物培养皿接种辅助定位器，包括圆柱台和定位标尺，所述圆柱台的上表面均匀分布有多个定位网格，定位标尺沿圆柱台的直径延伸设置，圆柱台的上表面还设有五个同心圆，五个同心圆由内到外直径逐渐增大，五个同心圆的直径分别对应五种常用培养皿的直径。本实用新型的微生物培养皿接种辅助定位器，可配合目前常用规格培养皿使用，可解决在菌株大量点接种过程中接种定位困难，接种效率低下等问题。使用本实用新型，可使培养皿上的微生物点接种能快速定位，缩短定位时间，节省实验人员的工作量，使接种效率更高，而且利用本实用新型对微生物进行点接种后，在培养基上生长的菌斑更加整齐一致，便于观察。