本发明公开一种基于图像重构算法的纵向层析成像方法，包括：利用激光产生的倏逝波，照明具有非线性效应的样品，并拍摄激发的荧光强度图像；将样品的归一化非线性发光效率与激光输入强度之间的关系曲线和倏逝波沿纵向强度分布曲线联立，获得描述样品纵向位置与其对拍摄的图像强度贡献之间关系的贡献曲线；改变倏逝波照明强度，使贡献曲线的线型发生改变，拍摄N幅对应不同强度下的图像，构建包含N个方程的方程组；使用图像重构算法在约束条件下求解方程组，获得倏逝波穿透深度内样品高分辨率、高精度的纵向空间分布。本发明可获得远高于倏逝波穿透深度的纵向分辨率和定位精度，无需控制倏逝波照明的全内反射角，适用于基于片上波导结构的倏逝波照明。