本发明提供了一种荧光探针及其制备方法和应用，属于过氧化氢检测术领域。本发明提供的荧光探针，具有式I所示的结构。本发明提供的荧光探针的分子中含有能够与过氧化氢发生作用的苯硼酸酯结构，对其它活性氧、活性氮、活性硫等物质具有抗干扰性，对过氧化氢的选择性高；荧光探针中的苯硼酸酯与过氧化氢反应后断开并被氧化成羟基，荧光探针的荧光强度相比于与过氧化氢反应前提高了30倍左右，颜色及荧光变化灵敏度高，从而实现了高选择性、高灵敏度地识别和检测水体或细胞中的过氧化氢；而且，本发明提供的荧光探针分子穿透细胞的渗透性好，毒性低，可以实现细胞内过氧化氢的荧光检测；在水体或细胞中的过氧化氢检测具有良好的应用前景。