本发明公开了一种抗菌糖肽水凝胶的制备方法，具体步骤如下：取葡甘聚糖与高碘酸钠发生反应，加入乙二醇终止反应，得到氧化葡甘聚糖，透析冻干，与抗菌肽混合反应，得到抗菌肽葡甘聚糖；将透明质酸与3‑马来酰亚胺基丙酸在室温下反应，得到酯化透明质酸，透析、冷冻干燥，然后与胶原肽混合，发生加成反应透析冻干，得到胶原肽透明质酸；将胶原肽透明质酸与抗菌肽葡甘聚糖混合制备成抗菌糖肽水凝胶。本发明所得水凝胶对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌等微生物菌具有良好的抗菌性能，水凝胶的制备工艺简单，可降解、生物相容性好。