本发明提出一种工业大麻性别连锁SNP分子标记、筛选方法及其应用，属于分子标记技术领域，能解决现有SNP分子标记存在准确性低，鉴定结果不理想的问题。该技术方案包括：将雄性特异性序列片段与大麻基因组数据库中的序列进行比对，获得工业大麻X染色体和Y染色体片段比对的差异；根据工业大麻X染色体和Y染色体片段比对的差异，以雄性特异性序列片段为模板设计多对特异性引物和多对随机简并引物，并以此作为引物进行多轮次PCR扩增反应；对多轮次PCR扩增反应所得PCR产物进行测序分析，筛选出雄性特异性序列片段的侧翼序列；将侧翼序列与大麻基因组数据库中的序列进行比对，根据比对结果确定SNP分子标记位点。本发明具有准确性高、性别区分度高等特点。