本发明属于生物技术领域，公开了非洲猪瘟病毒CD2v截短蛋白及在制备野毒和自然弱毒检测试剂盒中的应用。通过比对发现原核表达的CD2v截短蛋白作为ELISA包被抗原不能检测到非洲猪瘟病毒感染的阳性血清，而真核表达的CD2v蛋白作为ELISA包被抗原可以检测非洲猪瘟病毒感染的阳性血清。以真核表达CD2v蛋白作为包被抗原制备的间接ELISA试剂盒，同时配合以非洲猪瘟病毒p54蛋白为包被抗原的间接ELISA试剂盒，可用于鉴别ASFV野毒株和自然弱毒株的感染，操作步骤简单，结果可靠。因此，以本发明提供的真核表达的截短蛋白制备的非洲猪瘟病毒间接ELISA检测试剂盒非常适合临床大样本的检测，适合大规模推广。