血中舒芬太尼及其代谢物的超高压液质联用检验方法，包括如下步骤：准确移取0.5mL待测者血液于离心管中加入10μL的100ng/mL舒芬太尼D5溶液，加入1mL乙腈，涡旋振荡5min，12000r/min离心5min，取上清液过0.22μm滤膜，得进样液；进样液依次经过液相和质谱设备检测，得到对应图谱进行分析后判断待测者血液是否含有舒芬太尼及其代谢物。本发明在全国法庭科学领域中属首创，在很大程度上提高了舒芬太尼的检验水平，检验流程更规范，检验结论更可靠，更符合法庭科学领域中毒物毒品的检验要求；本发明具有节省分析时间、降低前处理的消耗成本、简便实用、准确稳定、易于推广等优势，不仅可应用于公安领域，对于临床诊断、环境保护、商品检验、卫生防疫等多领域均具有应用价值和潜力。