本发明公开了一种结核分枝杆菌的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用，所述MNP标记组合包括AL123456基因组上MNP‑1～MNP‑17的标记，具体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.17所示。所述引物对组合核苷酸序列如SEQ ID NO.18‑SEQ ID NO.51所示。所述MNP标记组合能特异的鉴定结核分枝杆菌并精细的区分不同的变种；所述引物互不干扰，综合多重扩增和测序技术，可一次性对多样本的所有标记组合进行序列分析，具有高通量、多靶点、高灵敏、高准确性和免培养的技术优势，可应用于大规模样本的结核分枝杆菌的精细鉴定、遗传变异检测和指纹数据库构建等，对结核分枝杆菌的监测、防治和科研具有重要意义。