本发明公开了一种检测人血清中皮质醇浓度的试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括盒体、内衬、皮质醇样本萃取液、皮质醇标准品、皮质醇质控品、空白质控品、说明书和靶值表，基于本发明提供的试剂盒的检测方法，先对样本进行前处理，再结合液相色谱串联质谱仪上样检测，最终采用内标法对皮质醇进行定量分析，得到人血清中皮质醇的浓度。本发明提供的试剂盒布局合理、利于操作，结合本发明提供的基于所述试剂盒的检测方法对皮质醇浓度进行检测，有效解决了血清中本底较大导致检测结果不准确的技术问题，本发明提供的试剂盒及检测方法前处理简单，灵敏度高且准确性和特异性较好，符合临床检测需求，降低了单次检测成本，提高了检测效率。