本发明公开了一种检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒及检测方法，试剂盒包括盒体、内衬、广口瓶、第一样本收集管、第二样本收集管和第三样本收集管，广口瓶内放有样本萃取液，第一样本收集管内放有校准品，第二样本收集管内放有质控品，第三样本收集管内放有空白质控品，第一样本收集管、第二样本收集管和第三样本收集管的内部均设置有玻璃纤维滤纸，玻璃纤维滤纸用于作为标准品和质控品的载体。基于本发明提供的试剂盒的检测方法，先对样本进行前处理，再结合液相色谱串联质谱仪上样检测，最终采用内标法对环孢霉素进行定量分析。本发明避免了红细胞压积效应的影响，降低了职业暴露的风险，提高了检测的稳定性和试剂盒的实用性。