本发明公开了一种鉴别非洲猪瘟Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株的双重荧光探针引物组合、试剂盒及其应用，属于分子生物学技术领域。所述双重荧光探针引物组合包括用于检测非洲猪瘟病毒Ⅰ型毒株的引物探针组和用于检测非洲猪瘟病毒通用P72基因的引物探针组。本发明通过在非洲猪瘟病毒的保守区对基因组进行分析比对，最终筛选出基因B117L并选择Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株具有较大差异的片段，进行探针引物的设计和反应条件优化，使两种病毒基因扩增效率相近，并研制方便诊断的试剂盒，可以一次性检出是非洲猪瘟病毒Ⅰ型感染、Ⅱ型感染或两种病毒共同感染，具有灵敏性高、特异性强、重复性好的优点，为猪场非洲猪瘟防控提供技术支持。