本发明公开了一种干细胞上清液提取方法，包括以下步骤：S1.获取间充质干细胞：从脂肪组织中获取间充质干细胞；S2.无血清培养：采用无血清培养基对间充质干细胞进行培养；S3.提取初始上清液：待细胞长满平底，收集培养基，离心，去除细胞碎片，得到初始上清液；S4.离心：取所述初始上清液在进一步梯度离心1800‑2400g离心8‑12min，除去死细胞和大的碎片，得到离心后的第一上清液；S5.细胞提取：将细胞碎片、死细胞和大的碎片用消化液消化后，再超声破碎，然后进一步梯度离心1800‑2400g离心8‑12min，得到第二上清液；S6.混合、过滤浓缩。本发明中获取间充质干细胞的过程能缩短脂肪间充质干细胞的提取时间，有效提高脂肪间充质干细胞的提取效率，同时保持传代稳定性。