本发明公开一种烟草内源抗烟草花叶病毒提取物及其制备方法和应用，包括：步骤1，提取：取晾干的烟草根茎粉碎，多次浸煮后蒸馏得到浸膏；步骤2，纯化：将所得浸膏依次经过浓缩、上色谱柱、洗脱、蒸馏得到浓缩液；步骤3，干燥：将浓缩液干燥并粉碎过100目筛后收集分装。本发明采用烟田废弃物，经溶剂提取、色谱分离的方法形成烟草内源抗病毒组份规模化生产工艺和质量控制方法，并对其使用方法和范围进行了明确，为利用进一步系统研究烟草内源抗烟草病毒病提供物质基础和科学依据，开创了一种田间病毒病防治新渠道，有效保证了烟草内源抗烟草花叶病毒组份制备过程的有序性和连贯性的同时也有效祛除了烟碱对目标产物的干扰，方法简单，可操作性强。