本发明公开了一种叶酸和维生素B12联合检测试剂盒，包括检测卡、标准曲线对照表、样本处理液，所述检测卡包括卡壳、设置在卡壳中的测试条，所述测试条包括底板、依次粘附在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫；所述结合垫上包被有量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的维生素B12抗体的混合物，所述硝酸纤维素膜采用纳米微球标记叶酸抗原和维生素B12抗原的方式实现两种蛋白的同时检测；所述标准曲线对照表设置在条形码或SD卡上，条形码印在卡壳的表面。还公开了一种叶酸和维生素B12联合检测试剂盒的制备方法。本发明灵敏度高、准确性好、方便快捷、成本低，能够对样本中的叶酸和维生素B12成分进行同时检测。