本发明涉及一种检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒及其制备方法与应用，属于生物医药检测技术领域。本发明所述的试剂盒，包括卡壳、位于所述卡壳内的试纸条；所述试纸条包括PVC底板、吸水垫、反应膜、结合垫和样品垫，所述结合垫上负载有胶体金标记的羊抗鼠IgG抗体和检测抗原；所述反应膜上设有检测线和质控线；所述检测线上包被有捕获抗原，所述质控线上包被有质控物；所述捕获抗原和检测抗原均为S‑RBD蛋白；编码所述S‑RBD蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述S‑RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述的试剂盒具有简便快捷、稳定性好、灵敏度高和特异性好等特点，对新冠病毒疫苗的效用评估、接种人群的筛查和随访康复人群中和抗体水平评估具有重要意义。