本发明公开了一种毛蕊花糖苷的分离纯化方法，涉及生物学技术领域，其根据中药地黄中分离提取的，该毛蕊花糖苷的分离方法包括以下步骤：准备材料和试剂；进行样品处理；毛蕊花糖苷的分离及纯化。本发明通过不使用价格昂贵、来源困难的β－葡萄糖苷酶作为酶解试剂，工艺路线更简洁，更容易实现工业化生产，采用本发明制备的毛蕊花糖苷含量比现有技术制备的毛蕊花糖苷含量高，能够满足申报新药对含量的要求，本发明所述的毛蕊花糖苷产品来源于玄参科植物，拓展了毛蕊花糖苷的植物来源、药源丰富，优化并改进了毛蕊花糖苷的提取制备方法，操作简便、成本低廉，操作中仅使用乙醇作为有机试剂，不采用甲醇、丙酮等毒性试剂，绿色环保。