本发明属于药物分析领域，具体涉及一种多组织中胆汁酸的液相色谱高分辨质谱定性定量检测方法。所述检测方法包括如下步骤：先配制混合内标工作液和标准溶液，将待测胆汁酸样品进行前处理，然后进行液相色谱质谱分析，其中液相色谱条件中流动相A为0.05‑0.2％甲酸水，流动相B为0.05‑0.2％甲酸乙腈，采用梯度洗脱，流速为350μl/min，柱温35‑45℃。质谱分析的条件为采用电喷雾离子源，负离子扫描，雾化器压力为48‑52psi；碰撞能量58‑62V；毛细管电压5.2‑5.7kV；离子温度590‑610℃；质量范围m/z 50‑800Da。本发明建立了一种多种组织中胆汁酸的定性定量检测方法，该方法可以实现鱼类、小鼠等动物各组织或胆南星等药材中多种类胆汁酸的定性定量检测，方法简单，试剂简单，检测灵敏。