本发明属于中药检测技术领域，具体提供了短穗兔耳草药材特征图谱及其构建方法和短穗兔耳草药材的质量检测方法，所述短穗兔耳草药材特征图谱的构建方法中，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为含磷酸的水溶液‑甲醇，梯度洗脱，在本发明的洗脱条件下得到6个共有特征峰，并实现了共有特征峰的有效分离，16min即可完成检测，所得特征峰专属性强，具有操作简单、快速、检测成本低、重现性好和信息量大等优点，能较全面地反映短穗兔耳草所含化学成分的种类与数量，对于有效控制短穗兔耳草及其提取物的质量具有重要意义。