本发明公开了一种耐热甘露糖苷酶基因及其表达蛋白和应用，通过蛋白质工程的相关技术手段，对酶进行定向改造以获得更符合要求的甘露糖苷酶。该甘露糖苷酶具有较好耐高温性能和偏酸性pH条件下高活性的特性。在75℃、pH为6.0的条件下酶活性最高，比酶活达到8.2μmol/mg min；该甘露糖苷酶在温度为70‑75℃、pH为6‑6.5的范围内，均具有较高的酶活。该甘露糖苷酶的耐热性能极高，在70‑75℃、pH 4.5‑7的环境中，孵育1 h酶活性能保持80%以上。与改造前相比，该甘露糖苷酶获得了转糖苷能力，在60%（w/w）甘露糖浓度、pH6、55℃、2d后，可以转化总糖约10%的甘露二糖和甘露三糖，与现有酶解法生产甘露二糖、三糖相比，产物相对单一纯净，实施简便，具有更大的优越性。