本发明公开了一种制备溶解氧饱和溶液的方法，首先在N个密闭容器内注入溶液，N≥3；然后通过气泵同时向各密闭容器内的溶液充入氧气或空气；取出一个密闭容器内的溶液并测定其溶解氧含量，至溶液中溶解氧过饱和，N‑1个待用溶液制备完毕；根据测定的溶解氧含量与理论饱和溶解氧值相比，计算得到将待用溶液的溶解氧含量由过饱和降为理论饱和值所需的亚硫酸钠量；向一个密闭容器内的待用溶液中加入步骤4计算所得量的亚硫酸钠后，测定其溶解氧含量，若结果近似该环境下的理论饱和溶解氧值，则向剩余密闭容器内的待用溶液也加入步骤4计算所得量的亚硫酸钠，从而得到N‑2个溶解氧饱和溶液。其可以方便、准确大批量制备溶解氧饱和溶液。