本发明公开了一种奶粉中胆碱含量的检测方法，属于食品检测方法领域，包括如下步骤：制备多组不同浓度的胆碱水溶液，所述胆碱水溶液的浓度范围为0.05mM‑5mM；分别取步骤1中的多组胆碱水溶液，并分别加入到胆碱氧化酶溶液和第一缓冲液的混合液中反应，反应后得到多组第一混合液；向步骤2所得的每组第一混合液中依顺序加入纳米酶复合物分散液、TMB溶液和第二缓冲液进行反应，反应后得到多组第二混合液；根据步骤3所得到的多个第二混合液的颜色与对应胆碱水溶液浓度的关系制定胆碱浓度比色卡。本发明中测定奶粉中胆碱含量的方法选择性良好，奶粉中的其他成分，如叶酸、牛磺酸等，对测定均无干扰。